CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE FIBROBLASTOS DÉRMICOS DE PEIXE-BOI-DAS-ANTILHAS (Trichechus manatus manatus) COMO FERRAMENTA PARA A CONSERVAÇÃO EX SITU

Resumo

Resumo
O peixe-boi das Antilhas, espécie ameaçada de extinção, demanda estratégias integradas e eficazes de conservação. Este estudo objetivou caracterizar linhagens celulares em passagens iniciais (2ª e 4ª passagem) a partir de biópsias de pele de indivíduos cativos. As células apresentaram alta viabilidade, atividade metabólica estável e capacidade proliferativa consistente ao longo das passagens analisadas, sem diferenças significativas. Esses resultados evidenciam a robustez do cultivo celular como ferramenta para a formação de biobancos e aplicações biotecnológicas, contribuindo diretamente para o fortalecimento das estratégias de conservação ex situ da espécie.

Palavras-chave: Biobancos. Células somáticas. Cultivo celular. Mamíferos aquáticos.

Introdução
O peixe-boi das Antilhas desempenha um papel ecológico fundamental, atuando na manutenção do equilíbrio dos ecossistemas (Garcés-Cuartas et al., 2025). Contudo, a espécie foi reclassificada globalmente como em perigo de extinção (Morales-Vela et al., 2024) e, especificamente no Brasil, como criticamente ameaçada (Attademo et al., 2025). Esse acentuado declínio populacional está associado tanto às baixas taxas reprodutivas intrínsecas à espécie quanto à intensificação de pressões antropogênicas. Nesse sentido, estratégias de conservação que integrem metodologias in situ e ex situ são essenciais para garantir a manutenção da espécie.
A coleta de amostras de pele de animais cativos se destaca, pois permite a obtenção de células somáticas in vitro (Nascimento et al., 2023). Isto permite o estabelecimento de linhagens celulares, as quais podem ser empregadas em biotecnologias, como a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), fundamentais para medicina regenerativa, reprodutiva e terapêutica (Jun et al. 2019). Ainda, essas amostras são valiosas para a formação de biobancos de recursos somáticos, contribuindo para a conservação da espécie a longo prazo.

Objetivos
Caracterizar linhagens celulares em passagens iniciais a partir do cultivo da derme de peixe-boi das Antilhas visando contribuir com a conservação ex situ da espécie.

Metodologia
O experimento foi conduzido de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais (no. 23091.010755/2019-32) e SISBIO (no. 71804-1). Os animais utilizados estavam alocados na Base Avançada do Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Mamíferos Aquáticos pelo Instituto Chico Mendes para a Conservação da Biodiversidade (CMA/ICMBio). As amostras foram coletadas de sete indivíduos vivos durante o manejo. Para tanto, os animais foram contidos, a região abdominal lateral foi desinfetada com um agente antisséptico tópico e foram coletadas biópsias de pele utilizando um punch dermatológico. As biópsias foram limpas e transportadas para o laboratório a 4 °C. No laboratório, foram processadas, fragmentadas e destinados ao cultivo em Meio essencial mínimo modificado de Dulbecco: mistura de nutrientes F-12 com 20% soro fetal bovino (SFB) e 2% antibiótico-antimicótico a 38,5 °C e 6,5% CO₂. Ao atingir confluência ao redor dos explantes, estes foram removidos e as células foram avaliadas na segunda passagem (2P) e quarta passagem (4P) quanto à viabilidade, metabolismo e atividade proliferativa.
Para a avaliação da viabilidade, células foram coradas com o corante azul de tripan (0,4%) e contadas usando câmara de Neubauer. A porcentagem de células viáveis ​​foi calculada dividindo-se o número de células viáveis ​​pelo número total de células contadas × 100. Para a avaliação do metabolismo, uma concentração celular foi distribuída em placa. Após 5 dias, a solução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (ensaio de MTT) foi adicionada a cada poço e incubado. Então, a solução foi removida e dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado sob agitação para solubilizar os cristais de formazan. As soluções formadas foram analisadas em espectrofotômetro. Para a avaliação da atividade proliferativa pelo tempo de duplicação da população (PDT), uma concentração de 1,0 × 10⁵ células/mL foi distribuída em placa e contada a cada 24 h usando câmara de Neubauer por 216 h. O PDT foi estimado de acordo com a equação PDT = T ln2/ ln (Xe/Xb), onde PDT é o tempo de cultivo (h), T é o tempo de incubação, Xb é o número de células no início da incubação, Xe é o número de células no final da incubação e ln é o logaritmo neperiano.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e analisados ​​utilizando o GraphPad Prism versão 7.0. Todos os resultados foram verificados quanto à normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e quanto à homocedasticidade pelo teste de Levene. Todos os dados foram analisados ​​por ANOVA seguida do teste de Tukey. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

Resultados e Discussão
Quanto à viabilidade, foram observadas taxas consistentemente altas, com valores de 87,3 ± 4,1% (2P) e 84,4 ± 3,3% (4P), que não apresentaram diferença estatística entre si (P > 0,05), indicando que houve a manutenção da integridade estrutural celular mesmo após o aumento do número de passagens. Taxas de viabilidade semelhantes já foram observadas em células primárias derivadas da pele de peixe-boi das Antilhas em estudo anterior (Nascimento et al., 2023), demonstrando que o aumento do tempo de cultivo e do número de passagens não causa efeitos significativos na membrana celular. Do mesmo modo, quanto ao metabolismo, o ensaio de MTT não revelou diferenças entre as passagens (P > 0,05), com taxas de 94,2 ± 2,2% (2P) e 78,3 ± 10,7% (4P). Esses achados indicam que as células mantiveram a função metabólica estável ao longo do período de cultivo, sugerindo a ausência de alterações ao longo das passagens. Esses achados corroboram com o observado em células primárias de peixe-boi (Nascimento et al., 2023). Quanto ao PDT, este permaneceu estatisticamente consistente ao longo das passagens analisadas (P > 0,05), com valores de 21,1 ± 1,5 h (2P) e 42,0 ± 11,2 h (4P). Esses resultados indicam que o aumento no número de passagens não afetou a capacidade proliferativa celular. Esses valores foram inferiores aos observados em células derivadas da pele de outros mamíferos aquáticos como baleia-jubarte (41 h, Burkard et al. 2015) e peixe-boi amazônico (63,7 h, Trichechus inunguis) (Tavares et al. 2024), demonstrando que as células de peixe-boi das Antilhas requerem menos tempo para se proliferar em condições in vitro.

Conclusão
Os resultados demonstram que as linhagens celulares de peixe-boi das Antilhas apresentam estabilidade estrutural, metabólica e proliferativa nas passagens iniciais, evidenciando sua adequação como modelo in vitro e reforçando seu potencial para aplicações biotecnológicas. Ainda, destaca-se a eficiência do princípio de conservação única, que alinha estratégias de conservação in situ e ex situ. Portanto, este estudo contribui para o fortalecimento de estratégias de conservação, ampliando as ferramentas disponíveis para a preservação da espécie.

Referências
ATTADEMO, F.L.N. et al. Trichechus manatus. Sistema de Avaliação do Risco de Extinção da Biodiversidade (SALVE) - Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), 2025.

BURKARD, M. et al. Establishment of the first humpback whale fibroblast cell lines and their application in chemical risk assessment. Aquatic Toxicology, v. 167, p. 240–247, 2015.

GARCÉS-CUARTAS, N. et al. Stable isotope analysis in bone collagen reveals new insights into the feeding ecology of free-ranging manatees in the Mexican Caribbean. Marine Ecology Progress Series, v. 758, p. 179–194, 2025.

MORALES-VELA, B. et al. Trichechus manatus ssp. manatus: The IUCN Red List of Threatened Species. IUCN, 2024.

JUN, S. et al. Single cell-derived clonally expanded mesenchymal progenitor cells from somatic cell nuclear transfer-derived pluripotent stem cells ameliorate the endometrial function in the uterus of a murine model with Asherman’s syndrome. Cell Proliferation, v. 52, p. e12597, 2019.

NASCIMENTO, M.B. et al. The initial steps toward the formation of somatic tissue banks and cell cultures derived from captive Antillean manatee (Trichechus manatus manatus) skin biopsies. Zoo Biology, v. 42, p. 709–722, 2023.

TAVARES, F.S. et al. Establishment and characterization of a primary fibroblast cell culture from the Amazonian manatee (Trichechus inunguis). Animals, v. 14, p. 686, 2024.