EFEITO DO FLUIDO FOLICULAR E SORO FETAL BOVINO NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS DE CATETOS (Pecari tajacu)

Resumo

Resumo
O objetivo foi avaliar o fluido folicular (FF) de cateto e do soro fetal bovino (SFB) na maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, bem como o impacto da fonte proteica no desenvolvimento embrionário in vitro (DIV). Os oócitos foram maturados e analisados quanto à extrusão do 1º corpúsculo polar (1CP) e progressão à metáfase II (MII), sendo o meio mais eficiente selecionado para a etapa embrionária. O grupo FF apresentou maiores taxas de 1CP (91,9%) e MII (79,2%), sem diferença estatística em relação ao SFB (P>0,05). Na DIV, o FF promoveu 64,4% de clivagem e 23,1% de blastocistos, indicando que ambas as fontes são viáveis para MIV, com destaque para o FF no desenvolvimento embrionário.

Palavras-chave: Conservação animal. Embrião. Fonte Proteica. Ungulados silvestres.

Introdução
O cateto é um ungulado pertencente à ordem Artiodátila, distribuído na América (Desbiez et al., 2012). Esta espécie reside em uma ampla diversidade de hábitats, que variam de florestas tropicais úmidas a regiões do semiárido (Galetti et al., 2015). Nesses territórios, os catetos podem atuar como indicadores da qualidade ambiental, dispersores de sementes e membros da cadeia alimentar (Desbiez et al., 2012; Galetti et al., 2015). Apesar da grande importância ecológica, as populações de catetos vêm sofrendo uma perda considerável em virtude do aumento da caça ilegal, degradação seu hábitat e competição com espécies exóticas (Galetti et al., 2015). Assim, torna-se essencial estudos de conservação da espécie, incluindo investigações sobre seus aspectos reprodutivos e uso de tecnologias reprodutivas.
Neste cenário, as etapas iniciais de manipulação de oócitos, como a maturação in vitro (MIV), ainda precisam ser mais bem compreendidas para aplicação efetiva. Borges et al. (2018) iniciaram estudos estabelecendo o tempo de MIV em 44-48 h, período semelhante aos suínos, espécie doméstica filogeneticamente próxima dos catetos. Posteriormente, oócitos foram ativados artificialmente, resultando em 27,6% de blastocistos (Borges et al., 2020). Esses resultados podem ser otimizados, especialmente no que diz respeito a maturação oocitária, a qual é estimulada pelas condições do meio de cultivo.
Nesse contexto, nos primeiros estudos em catetos foi utilizado o soro fetal bovino (SFB) como fonte proteica mais acessível e de uso comum para a maioria das espécies (Borges et al., 2018; 2020). Contudo, a adição do fluido folicular (FF) das fêmeas de cateto como fonte proteica poderia melhorar os resultados da MIV, assim como é comumente realizado na MIV de suínos (Currin et al., 2022).

Objetivos
Avaliar o efeito do fluido folicular e do soro fetal bovino sobre a maturação in vitro dos oócitos de catetos, caracterizando as taxas de maturação e desenvolvimento embrionário.

Metodologia
O experimento foi conduzido de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais (no. 30/2019) e SISBIO (no. 71834-1). Para tanto, 16 fêmeas do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA) foram estimuladas quatro dias antes usando PG600®. Posteriormente, os animais foram eutanasiados e os ovários coletados foram transportados ao laboratório (NaCl 9% com 0,05 mg/mL de penicilina a 37 °C). No laboratório, oócitos foram recuperados através da aspiração folicular utilizando meio de manipulação (MCM: TCM199 com 2,2 g/L bicarbonato sódio, 25 mM HEPES, 0,2 mM piruvato de sódio e 1% solução de antibiótico-antimicótico). Foram selecionados oócitos de grau I e II os quais foram submetidos à MIV nos grupos (FF e SFB) em meio MIV (MCM contendo 20 µg/mL FSH/LH, 10 ng/mL EGF, 100 μM cisteamina e 10% SFB ou 10% FF), durante 44 h.
Decorrido a MIV, oócitos foram desnudos usando a enzima hialuronidase (0,1%) e pipetagens. Em seguida, sob estereomicroscópio, foi avaliada a presença do primeiro corpúsculo polar (1CP), na qual os oócitos que apresentaram o 1CP foram considerados maturados. Posteriormente, todos os oócitos foram marcados com 10 μg/mL Hoechst 33342 por 15 min e avaliados sob microscopia de fluorescência para identificar o estágio nuclear, onde aqueles que apresentaram metáfase II foram considerados maturados.
Em uma segunda fase experimental para avaliar o desenvolvimento embrionário, a MIV foi realizada usando a melhor fonte proteica identificada. Após a MIV, os oócitos com 1CP foram submetidos ao protocolo de ativação artificial, utilizando ionomicina (5 μM) por 5 min, seguida da incubação (38,5 °C e 5,5% CO2) em 1,9 mM de 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) durante 3 h. Em seguida, oócitos foram submetidos ao desenvolvimento (DIV), sendo incubados por 7 dias em meio fluido sintético do oviduto (SOF) suplementado. Durante o DIV, foi avaliada a cinética embrionária. O dia da ativação foi considerado o dia 0 (D0), sendo no dia 3 (D3) avaliada a taxa de clivagem e no dia 7 (D7) a taxa de blastocistos.
Os dados obtidos foram expressos com média ± erro padrão, utilizando o software Star View 5.0. A normalidade e a homoscedasticidade foram verificadas pelos testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente. As taxas de maturação foram comparadas pelo teste Exato de Fisher, considerando P < 0,05.

Resultados e Discussão
Após a MIV, os grupos FF e SFB não apresentaram diferenças significativas em relação à presença do 1CP (Figura 1, P > 0,05). Ambos os grupos apresentaram taxas de maturação superiores a 70%, um valor considerado elevado para mamíferos silvestres, uma vez que o sucesso da MIV nesses animais raramente ultrapassa 60% (Santos et al., 2022). Ainda, as taxas de 1CP observadas foram semelhantes as taxas relatadas para suínos, espécie mais próxima filogeneticamente (Xu et al., 2020).
Considerando a dificuldade para obtenção de oócitos de catetos, devido a baixa disponibilidade de fêmeas e ausência de uma metodologia estabelecida para coleta in vivo, é importante considerar que o FF permitiu um maior número de oócitos maturados. Por essa razão, a ativação artificial e o desenvolvimento embrionário foram realizados apenas para o grupo de oócitos maturados com FF. Nesse grupo, foram observados 64,4 ± 9,8% de oócitos clivados. Dentre esses, 12,8 ± 4,0% apresentaram clivagens de 2 células, 84,6 ± 6,9% de 3 a 7 células e 2,6 ± 4,2% mais de 8 células. Ainda, foi obtida uma taxa de 23,1 ± 16,0% de blastocistos/clivados. Esses achados corroboram com o estudo de Borges et al. (2020), que também aplicaram o mesmo protocolo de ativação artificial em catetos, mas com a MIV realizada com SFB. Esses dados indicam que ambas as fontes proteicas podem ser utilizadas no sistema de MIV, possibilitando a obtenção de taxas satisfatórias para uma espécie silvestre.

Figura 1. Maturação in vitro de oócitos de catetos. (A) Imagem representativa do primeiro corpúsculo polar de oócitos de catetos após a MIV. (B) Efeito do fluido folicular de cateto e do soro fetal bovino sobre a maturação nuclear de oócitos de catetos.

Conclusão
O FF e o SFB mostram-se eficientes como fontes proteicas para a MIV de oócitos de catetos. Além disso, a MIV realizada com FF é capaz de promover o desenvolvimento de embriões após ativação artificial. Adicionalmente, o presente estudo é fundamental para compreender os próximos passos da produção in vitro de embriões em catetos e conservação da biodiversidade.

Referências
BORGES, A.A. et al. In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 38, p. 1863–1868, 2018.

BORGES, A.A. et al. Production of collared peccary (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) parthenogenic embryos following different oocyte chemical activation and in vitro maturation conditions. Theriogenology, v. 142, p. 320–327, 2020.

CURRIN, L. et al. Optimizing swine in vitro embryo production with growth factor and antioxidant supplementation during oocyte maturation. Theriogenology, v. 194, p. 133–143, 2022.

DESBIEZ, A.L.J. et al. Avaliação do risco de extinção do cateto Pecari tajacu Linnaeus, 1758, no Brasil. Biodiversidade Brasileira, v. 2, n. 1, p. 74–83, 2012.

GALETTI, M. et al. Diet overlap and foraging activity between feral pigs and native peccaries in the Pantanal. Plos One, v. 10, n. 11, e0141459, 2015.

SANTOS, M.V.O.; SILVA, A.R.; PEREIRA, A.F. Embryo production by in vitro fertilization in wild ungulates: progress and perspectives – a review. Annals of Animal Science, v. 22, n. 4, p. 1151–1162, 2022.

XU, H. et al. The effect of L-carnitine additive during in vitro maturation on the vitrification of pig oocytes. Cellular Reprogramming, v. 22, n. 4, p. 198–207, 2020.