INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE DIMETILSULFÓXIDO SOBRE A VIABILIDADE DE CÉLULAS SOMÁTICAS CRIOPRESERVADAS DO RATO-DE-NARIZ-VERMELHO (Wiedomys pyrrhorhinus)

Resumo

Resumo
Este estudo avaliou a viabilidade e a apoptose em células somáticas do rato-de-nariz-vermelho criopreservadas com diferentes concentrações de dimetilsulfóxido (DMSO; 10% e 2,5%). Após a criopreservação, as células foram analisadas quanto à viabilidade e aos níveis de apoptose. Observou-se que o grupo não criopreservado apresentou maior viabilidade (93,6 ± 3,0%), seguido pelo grupo com 10% de DMSO (80,3 ± 6,0%), sem diferença estatística (P > 0,05). Além disso, este grupo apresentou maior proporção de células viáveis. Os resultados indicam que 10% de DMSO favorece a manutenção da viabilidade celular e reduz a apoptose.

Palavras-chave: Conservação de recursos somáticos. Criopreservação celular. Cultivo in vitro. Roedores silvestres.

Introdução
Os roedores correspondem aproximadamente 37,5% das espécies de mamíferos na Caatinga (Delciellos, 2016). Dentre essas espécies, destaca-se o Wiedomys pyrrhorhinus (Wied-Neuwied, 1821), conhecido popularmente como rato-de-nariz-vermelho, o qual é um roedor de pequeno porte endêmico da Caatinga (Sobral et al., 2014). Espécies endêmicas apresentam maior suscetibilidade à ameaça de extinção diante de rápidas transformações ambientais (Zeng et al., 2019). Nesse contexto, estudos focados no desenvolvimento de protocolos de criopreservação são essenciais para o desenvolvimento de estratégias de conservação, sendo a criopreservação de células somáticas essencial na criação de criobancos.
Na criopreservação de células são utilizados crioprotetores, como o dimetilsulfóxido (DMSO). Estudos com fibroblastos fetais de espécies como porquinhos-da-índia demonstraram que o uso 10% de DMSO tem sido eficaz na preservação celular (Mehrabani et al., 2014). De forma semelhante, em fibroblastos de cutia-vermelha e preá, 10% DMSO tem sido empregada na criopreservação dessas células (Praxedes et al., 2021; Aquino et al., 2024). Embora o DMSO seja amplamente utilizado na criopreservação como crioprotetor intracelular, concentrações elevadas podem exercer efeitos citotóxicos, comprometendo a viabilidade celular e ocasionando danos estruturais. Nesse contexto, estudos buscam reduzir sua concentração nos protocolos de criopreservação, minimizando efeitos adversos sem comprometer a eficiência.

Objetivos
Avaliar o efeito de diferentes concentrações de dimetilsulfóxido (DMSO; 10% e 2,5%) sobre a viabilidade e os níveis de apoptose em células somáticas criopreservadas do rato-de-nariz-vermelho.
Metodologia
O experimento foi conduzido de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais (no. 48/2024) e SISBIO (no. 96958-1). Para tanto, foram utilizados cinco animais mantidos no Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA, Mossoró, RN). Explantes de tecido auricular (1–2 cm²) foram coletados e transportados ao Laboratório de Biotecnologia Animal em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM), suplementado com 15% de soro fetal bovino (SFB) e 2% de antibiótico-antimicótica a 4 °C. No laboratório, os explantes foram tricotomizados e fragmentados (9 mm³; 4 a 5 fragmentos) e cultivados em placas contendo meio de cultivo e incubados a 38,5 °C, 5,5% CO₂, com troca de meio cada 24 h. Após as células atingirem 70% de confluência, os fragmentos foram removidos. As células foram tripisinizadas (0,25 % tripsina, 0,05 % EDTA). As células foram cultivadas até a terceira passagem e, ao atingirem entre 70–80% de confluência foram divididas em dois grupos: não criopreservadas e criopreservadas por congelação lenta. As células foram criopreservadas utilizando diferentes soluções crioprotetoras contendo 2,5% ou 10% de DMSO e 0,2 M de sacarose. Após duas semanas, foram descongeladas e cultivadas.
As células foram avaliadas quanto à viabilidade por azul de tripan e apoptose. A viabilidade foi determinada pelo teste de azul de tripan a 0,4% (Praxedes et al., 2021) e avaliadas em câmara Neubauer sob um microscópio óptico. Células viáveis foram identificadas pela ausência de coloração, enquanto células não viáveis apresentaram coloração azul. A análise de apoptose foi realizada por meio de dupla marcação com acridina laranja (2 μg/mL) e brometo de etídio (10 μg/mL) e analisadas usando microscópio de fluorescência. As imagens foram registradas e 300 células foram avaliadas utilizando o software ImageJ. A classificação das células quanto ao estágio apoptótico sendo categorizadas em: células viáveis (verde uniforme), apoptose inicial (verde amarelado), apoptose tardia (laranja) e apoptose (vermelho).
Os dados foram expressos como média ± erro padrão (animal/repetição) e analisados no software GraphPad Prism, Teste de Shapiro-Wilk e de Levene e ANOVA seguida do teste de Tukey, com nível de significância de P < 0,05.

Resultados e Discussão
Ao avaliar a viabilidade celular pelo teste de azul de tripan (Figura 1A), observou-se que os grupos 10% de DMSO e o não criopreservado apresentaram viabilidade acima de 80,3% ± 6,0 e 93,6 ± 3,0% respectivamente (P > 0,05). Esses achados corroboram com estudos que ao usar 10% DMSO na criopreservação de fibroblastos do preá (Aquino et al., 2024). Liu et al. (2022) demonstraram que o uso da concentração de 10% de DMSO na criopreservação de fibroblastos de camundongos obtiveram viabilidade superior a 90%.
Por outro lado, a redução da concentração de DMSO para 2,5% (Figura 1A) resultou em diminuição significativa da viabilidade celular (52,0 ± 3,0%), diferindo do grupo não criopreservado (P < 0,05). Estudos demonstram que condrócitos criopreservados com 5% DMSO, a viabilidade foi reduzida (Liu et al., 2019). A análise dos níveis de apoptose (Figura 1B-C) confirmou esse padrão, onde o grupo não criopreservado e 10% DMSO, resultaram nas maiores proporções de células viáveis (79,3% ± 7,6, 72,6% ± 2,6). Por outro lado, 2,5% DMSO apresentaram baixa viabilidade e aumentos no apoptose tardia (44,8% ± 2,9) e necrose (18,9% ± 6,2).

Figura 1. Análise da viabilidade e níveis de apoptose em células somáticas do rato-de-nariz-vermelho criopreservadas em diferentes concentrações de DMSO. (A) Viabilidade celular pelo teste de azul de tripan; (B) Níveis de apoptose; (C) Imagem representativa das células viáveis (→), apoptose inicial (*), apoptose tardia (▲) e apoptóticas (⇢). Barra de escala = 100 µm.

Conclusão
O uso 10% de DMSO permite a manutenção da viabilidade e a redução dos níveis de apoptose em células somáticas. Por outro lado, a redução da concentração de DMSO para 2,5% resultou na diminuição da viabilidade celular e no aumento dos níveis de apoptose.

Referências
AQUINO, L.V.C. et al. L-Prolina como agente crioprotetor para a preservação de fibroblastos da pele de Galea spixii. Biopreservation and Biobanking, v. 23, p. 109-117, 2025.

DELCIELLOS, A.C. Mammals of four Caatinga areas in northeastern Brazil: inventory, species biology, and community structure. Check List: the journal of biodiversity, v. 12, p. 1-15, 2016.

LIU, et al. Reduced viability of chondrocytes cryopreserved with low DMSO. Cell Tissue Bank, v. 20, p. 321-329, 2019.

MEHRABANI, et al. Establishment, culture, and characterization of guinea pig fetal fibroblast cell, Vet. Med. Int. 2014.

PRAXEDES, E.A. et al. Establishment, characterization, and cryopreservation of cell lines derived from red-rumped agouti, Cryobiology, v. 98, p. 63-72, 2021.

SOBRAL, et al. Annual age structure and reproduction in the Caatinga red-nosed mouse, Wiedomys pyrrhorhinos (Rodentia, Sigmodontinae), Therya, v. 5, p. 509-534, 2014.

ZENG, et al. Cascading effects of forested area and isolation on seed dispersal effectiveness of rodents on subtropical islands, Journal of Ecology, v. 107, p. 1506-1517, 2019